在(Zai)继(Ji)续(Xu)介(Jie)绍(Shao)Hela S3人(Ren)宫(Gong)颈(Jing)癌(Ai)细(Xi)胞(Bao)株(Zhu)的(De)操(Cao)作(Zuo)步(Bu)骤(Zhou)时(Shi)，(?)我(Wo)们(Men)需(Xu)格(Ge)外(Wai)注(Zhu)意(Yi)无(Wu)菌(Jun)操(Cao)作(Zuo)与(Yu)细(Xi)胞(Bao)培(Pei)养(Yang)环(Huan)境(Jing)的(De)稳(Wen)定(Ding)。(?)接(Jie)下(Xia)来(Lai)，(?)将(Jiang)详(Xiang)细(Xi)阐(Chan)述(Shu)细(Xi)胞(Bao)复(Fu)苏(Su)、(?)培(Pei)养(Yang)、(?)传(Chuan)代(Dai)及(Ji)冻(Dong)存(Cun)的(De)关(Guan)键(Jian)步(Bu)骤(Zhou)：(?)

 细(Xi)胞(Bao)复(Fu)苏(Su)

1. **预(Yu)热(Re)培(Pei)养(Yang)基(Ji)**：(?)将(Jiang)含(Han)有(You)10%胎(Tai)牛(Niu)血(Xue)清(Qing)的(De)DMEM培(Pei)养(Yang)基(Ji)置(Zhi)于(Yu)37℃(?)水(Shui)浴(Yu)锅(Guo)中(Zhong)预(Yu)热(Re)，(?)确(Que)保(Bao)温(Wen)度(Du)适(Shi)宜(Yi)细(Xi)胞(Bao)生(Sheng)长(Chang)。(?)
2. **快(Kuai)速(Su)解(Jie)冻(Dong)**：(?)从(Cong)液(Ye)氮(Dan)罐(Guan)中(Zhong)迅(Xun)速(Su)取(Qu)出(Chu)冻(Dong)存(Cun)的(De)Hela S3细(Xi)胞(Bao)，(?)立(Li)即(Ji)放(Fang)入(Ru)37℃(?)水(Shui)浴(Yu)中(Zhong)，(?)轻(Qing)轻(Qing)摇(Yao)晃(Huang)冻(Dong)存(Cun)管(Guan)，(?)使(Shi)其(Qi)在(Zai)1分(Fen)钟(Zhong)内(Nei)融(Rong)化(Hua)。(?)
3. **离(Li)心(Xin)洗(Xi)涤(Di)**：(?)将(Jiang)细(Xi)胞(Bao)悬(Xuan)液(Ye)转(Zhuan)移(Yi)至(Zhi)15mL离(Li)心(Xin)管(Guan)中(Zhong)，(?)加(Jia)入(Ru)等(Deng)体(Ti)积(Ji)预(Yu)热(Re)的(De)培(Pei)养(Yang)基(Ji)，(?)轻(Qing)轻(Qing)混(Hun)匀(Yun)后(Hou)，(?)以(Yi)800-1000rpm的(De)速(Su)度(Du)离(Li)心(Xin)5分(Fen)钟(Zhong)，(?)弃(Qi)去(Qu)上(Shang)清(Qing)以(Yi)去(Qu)除(Chu)DMSO。(?)
4. **重(Zhong)悬(Xuan)接(Jie)种(Zhong)**：(?)向(Xiang)细(Xi)胞(Bao)沉(Chen)淀(Dian)中(Zhong)加(Jia)入(Ru)适(Shi)量(Liang)预(Yu)热(Re)的(De)培(Pei)养(Yang)基(Ji)，(?)轻(Qing)轻(Qing)吹(Chui)打(Da)制(Zhi)成(Cheng)单(Dan)细(Xi)胞(Bao)悬(Xuan)液(Ye)，(?)随(Sui)后(Hou)接(Jie)种(Zhong)至(Zhi)已(Yi)预(Yu)先(Xian)用(Yong)培(Pei)养(Yang)基(Ji)润(Run)洗(Xi)的(De)培(Pei)养(Yang)皿(Min)中(Zhong)，(?)置(Zhi)于(Yu)37℃(?)、(?)5% CO的(De)恒(Heng)温(Wen)培(Pei)养(Yang)箱(Xiang)中(Zhong)培(Pei)养(Yang)。(?)
细(Xi)胞(Bao)培(Pei)养(Yang)与(Yu)观(Guan)察(Cha)

- **日(Ri)常(Chang)观(Guan)察(Cha)**：(?)每(Mei)日(Ri)使(Shi)用(Yong)倒(Dao)置(Zhi)显(Xian)微(Wei)镜(Jing)观(Guan)察(Cha)细(Xi)胞(Bao)形(Xing)态(Tai)、(?)生(Sheng)长(Chang)状(Zhuang)态(Tai)及(Ji)培(Pei)养(Yang)基(Ji)颜(Yan)色(Se)，(?)适(Shi)时(Shi)更(Geng)换(Huan)新(Xin)鲜(Xian)培(Pei)养(Yang)基(Ji)，(?)防(Fang)止(Zhi)细(Xi)胞(Bao)污(Wu)染(Ran)和(He)营(Ying)养(Yang)耗(Hao)尽(Jin)。(?)
- **换(Huan)液(Ye)**：(?)通(Tong)常(Chang)每(Mei)2-3天(Tian)更(Geng)换(Huan)一(Yi)次(Ci)培(Pei)养(Yang)基(Ji)，(?)以(Yi)维(Wei)持(Chi)细(Xi)胞(Bao)生(Sheng)长(Chang)环(Huan)境(Jing)的(De)稳(Wen)定(Ding)。(?)

 细(Xi)胞(Bao)传(Chuan)代(Dai)

1. **消(Xiao)化(Hua)处(Chu)理(Li)**：(?)当(Dang)细(Xi)胞(Bao)密(Mi)度(Du)达(Da)到(Dao)80%-90%时(Shi)，(?)吸(Xi)去(Qu)旧(Jiu)培(Pei)养(Yang)基(Ji)，(?)用(Yong)PBS轻(Qing)轻(Qing)洗(Xi)涤(Di)细(Xi)胞(Bao)一(Yi)次(Ci)，(?)加(Jia)入(Ru)适(Shi)量(Liang)的(De)消(Xiao)化(Hua)液(Ye)，(?)置(Zhi)于(Yu)培(Pei)养(Yang)箱(Xiang)中(Zhong)孵(Fu)育(Yu)至(Zhi)细(Xi)胞(Bao)开(Kai)始(Shi)变(Bian)圆(Yuan)并(Bing)脱(Tuo)落(Luo)。(?)
2. **终(Zhong)止(Zhi)消(Xiao)化(Hua)**：(?)加(Jia)入(Ru)含(Han)血(Xue)清(Qing)的(De)培(Pei)养(Yang)基(Ji)终(Zhong)止(Zhi)消(Xiao)化(Hua)，(?)轻(Qing)轻(Qing)吹(Chui)打(Da)使(Shi)细(Xi)胞(Bao)脱(Tuo)落(Luo)并(Bing)分(Fen)散(San)成(Cheng)单(Dan)细(Xi)胞(Bao)悬(Xuan)液(Ye)。(?)
3. **细(Xi)胞(Bao)计(Ji)数(Shu)与(Yu)分(Fen)盘(Pan)**：(?)取(Qu)少(Shao)量(Liang)细(Xi)胞(Bao)悬(Xuan)液(Ye)进(Jin)行(Xing)计(Ji)数(Shu)，(?)根(Gen)据(Ju)实(Shi)验(Yan)需(Xu)要(Yao)调(Diao)整(Zheng)细(Xi)胞(Bao)密(Mi)度(Du)后(Hou)，(?)接(Jie)种(Zhong)至(Zhi)新(Xin)的(De)培(Pei)养(Yang)皿(Min)中(Zhong)继(Ji)续(Xu)培(Pei)养(Yang)。(?)

细(Xi)胞(Bao)冻(Dong)存(Cun)

1. **准(Zhun)备(Bei)冻(Dong)存(Cun)液(Ye)**：(?)按(An)培(Pei)养(Yang)基(Ji):血(Xue)清(Qing):DMSO = 7:2:1的(De)比(Bi)例(Li)配(Pei)制(Zhi)细(Xi)胞(Bao)冻(Dong)存(Cun)液(Ye)，(?)置(Zhi)于(Yu)4℃(?)预(Yu)冷(Leng)。(?)
2. **细(Xi)胞(Bao)收(Shou)集(Ji)**：(?)同(Tong)细(Xi)胞(Bao)传(Chuan)代(Dai)中(Zhong)的(De)消(Xiao)化(Hua)处(Chu)理(Li)步(Bu)骤(Zhou)，(?)收(Shou)集(Ji)处(Chu)于(Yu)对(Dui)数(Shu)生(Sheng)长(Chang)期(Qi)的(De)细(Xi)胞(Bao)。(?)
3. **重(Zhong)悬(Xuan)与(Yu)冻(Dong)存(Cun)**：(?)将(Jiang)细(Xi)胞(Bao)悬(Xuan)液(Ye)转(Zhuan)移(Yi)至(Zhi)冻(Dong)存(Cun)管(Guan)中(Zhong)，(?)逐(Zhu)滴(Di)加(Jia)入(Ru)预(Yu)冷(Leng)的(De)冻(Dong)存(Cun)液(Ye)，(?)边(Bian)加(Jia)边(Bian)轻(Qing)轻(Qing)晃(Huang)动(Dong)，(?)使(Shi)细(Xi)胞(Bao)均(Jun)匀(Yun)分(Fen)散(San)。(?)随(Sui)后(Hou)，(?)将(Jiang)冻(Dong)存(Cun)管(Guan)放(Fang)入(Ru)程(Cheng)序(Xu)降(Jiang)温(Wen)盒(He)中(Zhong)，(?)置(Zhi)于(Yu)-80℃(?)冰(Bing)箱(Xiang)过(Guo)夜(Ye)，(?)最(Zui)后(Hou)转(Zhuan)移(Yi)至(Zhi)液(Ye)氮(Dan)罐(Guan)中(Zhong)长(Chang)期(Qi)保(Bao)存(Cun)。(?)

通(Tong)过(Guo)以(Yi)上(Shang)细(Xi)致(Zhi)的(De)操(Cao)作(Zuo)步(Bu)骤(Zhou)，(?)可(Ke)以(Yi)确(Que)保(Bao)Hela S3人(Ren)宫(Gong)颈(Jing)癌(Ai)细(Xi)胞(Bao)株(Zhu)在(Zai)实(Shi)验(Yan)室(Shi)中(Zhong)的(De)稳(Wen)定(Ding)传(Chuan)代(Dai)与(Yu)高(Gao)效(Xiao)利(Li)用(Yong)。(?)